基因线路课程汇报

我本次报告讲述的文献是 Tamsir 等人在2011年1月13日发表在《Natural》的"Robust multicellular computing using genetically encoded NOR gates and chemical 'wires'"，翻译过来为“利用基因编码的或非门和化学‘导线’进行鲁棒性多细胞计算”。

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## 文章研究背景和重要性

人工合成基因线路研究在此文章发表前几年有了很大进展，一方面得益于对基本电路如拨动开关、振荡电路等的研究，另一方面则得益于实验技术的进步。

为了释放合成生物学家的创造力，基础的线路必须实现真正的可互换，即模块化和可扩展。Tamsir 等人利用大肠杆菌中的细菌的“群体感应” 通过执行简单逻辑功能的单个细胞之间的通信实现复杂计算。

**这种细胞外的“化学布线”是一种很有希望的方法，可以避免在单个细胞内运行时需要隔离不同基因线路的困难，对相关领域的研究都具有举足轻重的作用。**

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## 文章发表前已有的研究

#### ⒈已经构建的几种原型基因线路

通过模拟转录、翻译和蛋白降解等生化反应构建的基因线路可执行非门操作，在此基础上，将两个非门相串联构成与非门，采用类似的方法构建了与门、或门和蕴涵门等逻辑操作基因线路。

理论上，应用这些基因线路可执行任意逻辑操作。参照如何编写程序并装入电脑，人们可以按照类似的方式，依据基因线路重组 DNA 序列，进一步将这些 DNA 分子转入细胞，实现利用细胞进行编程。

已构建了的几个原型基因线路，它们在体内分别完成特定的功能；一是自抑制子，一个抑制因子通过调控自身的合成而降低基因表达中的噪音；二是套环开关，两个抑制因子互相抑制对方的合成，达到一个双稳态系统；三是震动子，通过3个抑制因子连接成一个环，从而产生可重复的震动子。

![双稳态开关（Genetic Toggle Switch）、震荡器（Genetic Repressilator）和人造细胞通讯系统（Cell-cell Communication Circuits）](https://cloud.wangyan.life/d/wangyan.life/Pictures/2-Skills/0004-0001.webp)

除双稳态开关（Genetic Toggle Switch）、震荡器（Genetic Repressilator）和人造细胞通讯系统（Cell-cell Communication Circuits）外，Weiss 等人还构建了用于处理简单数字逻辑门的基因网络。

#### ⒉基因线路的信号检测

在自然状态下，细胞通常采用数字式和模拟式两种信息处理方式分析细胞间的通讯信号和外界刺激信号。比如，细菌通过趋化作用向富含营养区域的移动；在胚胎形成中基于化学信号梯度而产生的细胞分化。

为增强细胞对内外部信息的数字化处理能力，研究者致力于用基因线路模拟细胞信号处理过程，比如， Weiss 等人构建的基因线路可使细胞检测不同的化学物质浓度（在某一特定阈值范围内），Basu 等人构建的基因线路可对多种环境信号发生反应。

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## 文章研究的重要科学问题

**如何在已构建的几种原型基因线路的基础上实现更复杂的逻辑门功能，并将这些逻辑门用特殊的“导线”串联起来以实现细胞间的通讯和更复杂的细胞计算？**

此研究对该问题的回答是：在建立更复杂的逻辑门后将其插入到不同的大肠杆菌菌株中，这些逻辑门通过“群体感应”控制着信号分子的释放和感知，从而使得不同菌落之间的各个逻辑门之间彼此联系，这些“相互连接”的菌落可以像微型电脑一样进行编程，从而实现复杂的计算。

![菌落的空间排列](https://cloud.wangyan.life/d/wangyan.life/Pictures/2-Skills/0004-0002.webp)

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## 研究方法

此研究采用了自下而上的构建方法：通过工程化方法，利用标准化模块，由简单到复杂地构建具有期望功能的生物系统。

#### ⒈菌株、质粒和培养基

所有的研究都使用大肠杆菌菌株 DH10B 进行。使用 Luria-Bertani (LB) – Miller 培养基进行检测。

#### ⒉传递功能表征

将携带适当质粒的细胞在一定条件下的肉汤培养基中培养，不添加诱导剂。然后将培养物稀释一定倍数到一定量新鲜肉汤培养基中（此时补充适当的诱导剂），在 96 孔板格式中再培养一定时间，最后稀释一定倍数到 PBS 溶液（即磷酸盐缓冲溶液）中进行流式细胞仪分析（使用的是 BD 公司生产的 FACS LSR2 流式细胞仪）。

#### ⒊电路功能的平板检测

将 LB 肉汤琼脂培养基辅以诱导剂倒入培养皿，制备平板培养基。通过点播适当的细菌菌株的过夜培养，在平板上 “制造 ”细菌逻辑门，以模拟每个逻辑电路的空间排列。在方形网格中，每两个菌落之间的距离被设定为一定长度。从上一层的斑点开始，延迟一定的时间再进行点样，以确保通信信号得到充分的传播。在最后一层点样一定时间后，用接种环刮取电路的整个输出菌落，并将其稀释到 PBS 溶液中进行细胞测量分析。

#### ⒋流式细胞仪分析

所有获得的数据包含至少 50,000 个结果，使用 MATLAB 通过正向和侧向散射对结果进行门控。计算出荧光分布的几何平均值，再从这些数值中减去大肠杆菌 DH10B 细胞的自发荧光值，得到本研究中报告的荧光值。

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## 研究内容

#### ⒈复杂逻辑门的构建

或非门和与非门是非常独特的，它们在功能上是完整的，任何计算操作都可以通过将这些门中的任何一个单独分层来实现。在这些逻辑门中，或非门是最简单的，可以使用现有的元件来实现。一个或非门只有在两个输入都是 “关闭 ”时才会 “打开”，因此可以通过在一个非门上添加第二个输入启动子来设计一个简单的或非门，具有相同方向的串联启动子驱动转录抑制器的表达，而串联启动子在原核生物基因组中很常见。

这样将会产生一个或门的功能；然而，启动子之间会发生干扰。抑制器关闭下游的启动子，作为门的输出，该逻辑门的输入和输出都是启动子；因此，可以将多个门分层，以产生更复杂的逻辑运算。

![或非门的符号和真值表](https://cloud.wangyan.life/d/wangyan.life/Pictures/2-Skills/0004-0003.webp)

![或非门的遗传图](https://cloud.wangyan.life/d/wangyan.life/Pictures/2-Skills/0004-0004.webp)

通过在不同的空间位置中排列菌落，产生了所有可能的两个输入门，包括复杂的异或门和异或非门。该图展示的是异或门的结构，由三层或非门共四种菌落组成，只有当其中两个输入信号的其中一个为“是”时，输出信号才为“是”。

![a. 四个菌落，每个菌落由含有单个门的菌株组成，这样计算从左到右进行，每层的结果通过群体信号进行通信。将输入（Ara 和 aTc）均匀地加到板上。b. 菌落的空间排列。c. 每个菌落对输入信号的组合作出适当的响应。荧光值及其误差条根据三个实验的平均 s.d. 计算。d. 异或门（单元 4）的细胞计量数据。](https://cloud.wangyan.life/d/wangyan.life/Pictures/2-Skills/0004-0005.webp)

#### ⒉逻辑门之间的连接

通过排列两个串联启动子在大肠杆菌中构建一个简单的或非门，再以这两个启动子作为输入来驱动阻遏子的转录，阻遏物又可以使作为输出的启动子失活。

单个大肠杆菌菌落携带相同的或非门，但输入和输出连接到不同的正交群体感应的“发送器”和“接收器”，这些群体感应信号分子形成了各个逻辑门之间的“导线”。

由“导线”连接不同的菌落，便组合出能够行使不同功能的复杂逻辑结构。

![发现含有不同门的菌落，以模拟每个逻辑电路的空间排列。对于每个回路，通过流式细胞仪对添加到板中的所有诱导剂组合的最终集落进行分析。荧光值及其误差条根据三个实验的平均 s.d. 计算。](https://cloud.wangyan.life/d/wangyan.life/Pictures/2-Skills/0004-0006.webp)

#### ⒊模块化设计

这些或门和或非门使用启动子作为输入，这一特点赋予了门的模块化性质，使它们可以被设计成通过更换启动子来响应不同的输入。

如图为三种不同串联启动子组成的或门和或非门的特征数据，六个逻辑门的预测传递功能与实验结果相吻合。

![a. 将三个或门（左）的传递函数与预测的传递函数（右）进行比较,预测的传递函数是针对单个启动子测量的传递函数的简单和。b. 将三个或非门（左）的传递函数与预测的传递函数（右）进行比较,数据代表了从三个实验中计算出的平均值。](https://cloud.wangyan.life/d/wangyan.life/Pictures/2-Skills/0004-0007.webp)

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## 创新点

⒈通过对不同的简单逻辑门的串联组合构建出了更复杂的逻辑门；

⒉通过利用不同菌落间的“群体感应”现象，连接各个不同的菌落，组合出能够行使不同功能的复杂逻辑结构；

⒊使用启动子作为输入，赋予了逻辑门以模块化的性质，使它们可以被设计成通过更换启动子来响应不同的输入；

⒋这种在细胞外的“化学布线” 方法，可以避免在单个细胞内运行时需要隔离不同基因线路的困难，对相关领域的研究都具有举足轻重的作用。

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## 应用前景

目前最通用的电子计算机是数字计算机，也就是说，通过对１与０阵列的逻辑运算来获得更复杂的功能，最终产生大多数人们所熟悉的相关软件。而其实这些逻辑运算也是细胞计算的基础，我们通常可以想到电子流能做运算的工作，但是实际上任何基质都可以有类似电脑的表现，因此这项研究成果将有助于未来生物计算机、生物信息学、DNA 存储等相关方向的研究。

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&emsp;&emsp;我本次报告讲述的文献是 Tamsir 等人在2011年1月13日发表在《Natural》的"Robust multicellular computing using genetically encoded NOR gates and chemical 'wires'"，翻译过来为“利用基因编码的或非门和化学‘导线’进行鲁棒性多细胞计算”。

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## 文章研究背景和重要性

&emsp;&emsp;人工合成基因线路研究在此文章发表前几年有了很大进展，一方面得益于对基本电路如拨动开关、振荡电路等的研究，另一方面则得益于实验技术的进步。

&emsp;&emsp;为了释放合成生物学家的创造力，基础的线路必须实现真正的可互换，即模块化和可扩展。Tamsir 等人利用大肠杆菌中的细菌的“群体感应” 通过执行简单逻辑功能的单个细胞之间的通信实现复杂计算。

&emsp;&emsp;**这种细胞外的“化学布线”是一种很有希望的方法，可以避免在单个细胞内运行时需要隔离不同基因线路的困难，对相关领域的研究都具有举足轻重的作用。**

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## 文章发表前已有的研究

#### ⒈已经构建的几种原型基因线路

&emsp;&emsp;通过模拟转录、翻译和蛋白降解等生化反应构建的基因线路可执行非门操作，在此基础上，将两个非门相串联构成与非门，采用类似的方法构建了与门、或门和蕴涵门等逻辑操作基因线路。

&emsp;&emsp;理论上，应用这些基因线路可执行任意逻辑操作。参照如何编写程序并装入电脑，人们可以按照类似的方式，依据基因线路重组 DNA 序列，进一步将这些 DNA 分子转入细胞，实现利用细胞进行编程。

&emsp;&emsp;已构建了的几个原型基因线路，它们在体内分别完成特定的功能；一是自抑制子，一个抑制因子通过调控自身的合成而降低基因表达中的噪音；二是套环开关，两个抑制因子互相抑制对方的合成，达到一个双稳态系统；三是震动子，通过3个抑制因子连接成一个环，从而产生可重复的震动子。

&emsp;&emsp;除双稳态开关（Genetic Toggle Switch）、震荡器（Genetic Repressilator）和人造细胞通讯系统（Cell-cell Communication Circuits）外，Weiss 等人还构建了用于处理简单数字逻辑门的基因网络。

#### ⒉基因线路的信号检测

&emsp;&emsp;在自然状态下，细胞通常采用数字式和模拟式两种信息处理方式分析细胞间的通讯信号和外界刺激信号。比如，细菌通过趋化作用向富含营养区域的移动；在胚胎形成中基于化学信号梯度而产生的细胞分化。

&emsp;&emsp;为增强细胞对内外部信息的数字化处理能力，研究者致力于用基因线路模拟细胞信号处理过程，比如， Weiss 等人构建的基因线路可使细胞检测不同的化学物质浓度（在某一特定阈值范围内），Basu 等人构建的基因线路可对多种环境信号发生反应。

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## 文章研究的重要科学问题

&emsp;&emsp;**如何在已构建的几种原型基因线路的基础上实现更复杂的逻辑门功能，并将这些逻辑门用特殊的“导线”串联起来以实现细胞间的通讯和更复杂的细胞计算？**

&emsp;&emsp;此研究对该问题的回答是：在建立更复杂的逻辑门后将其插入到不同的大肠杆菌菌株中，这些逻辑门通过“群体感应”控制着信号分子的释放和感知，从而使得不同菌落之间的各个逻辑门之间彼此联系，这些“相互连接”的菌落可以像微型电脑一样进行编程，从而实现复杂的计算。

![菌落的空间排列](https://cloud.wangyan.life/d/wangyan.life/Pictures/2-Skills/0004-0002.webp)

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## 研究方法

&emsp;&emsp;此研究采用了自下而上的构建方法：通过工程化方法，利用标准化模块，由简单到复杂地构建具有期望功能的生物系统。

#### ⒈菌株、质粒和培养基

&emsp;&emsp;所有的研究都使用大肠杆菌菌株 DH10B 进行。使用 Luria-Bertani (LB) – Miller 培养基进行检测。

#### ⒉传递功能表征

&emsp;&emsp;将携带适当质粒的细胞在一定条件下的肉汤培养基中培养，不添加诱导剂。然后将培养物稀释一定倍数到一定量新鲜肉汤培养基中（此时补充适当的诱导剂），在 96 孔板格式中再培养一定时间，最后稀释一定倍数到 PBS 溶液（即磷酸盐缓冲溶液）中进行流式细胞仪分析（使用的是 BD 公司生产的 FACS LSR2 流式细胞仪）。

#### ⒊电路功能的平板检测

&emsp;&emsp;将 LB 肉汤琼脂培养基辅以诱导剂倒入培养皿，制备平板培养基。通过点播适当的细菌菌株的过夜培养，在平板上 “制造 ”细菌逻辑门，以模拟每个逻辑电路的空间排列。在方形网格中，每两个菌落之间的距离被设定为一定长度。从上一层的斑点开始，延迟一定的时间再进行点样，以确保通信信号得到充分的传播。在最后一层点样一定时间后，用接种环刮取电路的整个输出菌落，并将其稀释到 PBS 溶液中进行细胞测量分析。

#### ⒋流式细胞仪分析

&emsp;&emsp;所有获得的数据包含至少 50,000 个结果，使用 MATLAB 通过正向和侧向散射对结果进行门控。计算出荧光分布的几何平均值，再从这些数值中减去大肠杆菌 DH10B 细胞的自发荧光值，得到本研究中报告的荧光值。

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## 研究内容

#### ⒈复杂逻辑门的构建

&emsp;&emsp;或非门和与非门是非常独特的，它们在功能上是完整的，任何计算操作都可以通过将这些门中的任何一个单独分层来实现。在这些逻辑门中，或非门是最简单的，可以使用现有的元件来实现。一个或非门只有在两个输入都是 “关闭 ”时才会 “打开”，因此可以通过在一个非门上添加第二个输入启动子来设计一个简单的或非门，具有相同方向的串联启动子驱动转录抑制器的表达，而串联启动子在原核生物基因组中很常见。

&emsp;&emsp;这样将会产生一个或门的功能；然而，启动子之间会发生干扰。抑制器关闭下游的启动子，作为门的输出，该逻辑门的输入和输出都是启动子；因此，可以将多个门分层，以产生更复杂的逻辑运算。

![或非门的符号和真值表](https://cloud.wangyan.life/d/wangyan.life/Pictures/2-Skills/0004-0003.webp)

![或非门的遗传图](https://cloud.wangyan.life/d/wangyan.life/Pictures/2-Skills/0004-0004.webp)

&emsp;&emsp;通过在不同的空间位置中排列菌落，产生了所有可能的两个输入门，包括复杂的异或门和异或非门。该图展示的是异或门的结构，由三层或非门共四种菌落组成，只有当其中两个输入信号的其中一个为“是”时，输出信号才为“是”。

#### ⒉逻辑门之间的连接

&emsp;&emsp;通过排列两个串联启动子在大肠杆菌中构建一个简单的或非门，再以这两个启动子作为输入来驱动阻遏子的转录，阻遏物又可以使作为输出的启动子失活。

&emsp;&emsp;单个大肠杆菌菌落携带相同的或非门，但输入和输出连接到不同的正交群体感应的“发送器”和“接收器”，这些群体感应信号分子形成了各个逻辑门之间的“导线”。

&emsp;&emsp;由“导线”连接不同的菌落，便组合出能够行使不同功能的复杂逻辑结构。

#### ⒊模块化设计

&emsp;&emsp;这些或门和或非门使用启动子作为输入，这一特点赋予了门的模块化性质，使它们可以被设计成通过更换启动子来响应不同的输入。

&emsp;&emsp;如图为三种不同串联启动子组成的或门和或非门的特征数据，六个逻辑门的预测传递功能与实验结果相吻合。

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## 创新点

&emsp;&emsp;⒈通过对不同的简单逻辑门的串联组合构建出了更复杂的逻辑门；

&emsp;&emsp;⒉通过利用不同菌落间的“群体感应”现象，连接各个不同的菌落，组合出能够行使不同功能的复杂逻辑结构；

&emsp;&emsp;⒊使用启动子作为输入，赋予了逻辑门以模块化的性质，使它们可以被设计成通过更换启动子来响应不同的输入；

&emsp;&emsp;⒋这种在细胞外的“化学布线” 方法，可以避免在单个细胞内运行时需要隔离不同基因线路的困难，对相关领域的研究都具有举足轻重的作用。

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## 应用前景

&emsp;&emsp;目前最通用的电子计算机是数字计算机，也就是说，通过对１与０阵列的逻辑运算来获得更复杂的功能，最终产生大多数人们所熟悉的相关软件。而其实这些逻辑运算也是细胞计算的基础，我们通常可以想到电子流能做运算的工作，但是实际上任何基质都可以有类似电脑的表现，因此这项研究成果将有助于未来生物计算机、生物信息学、DNA 存储等相关方向的研究。

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文章标题：基因线路课程汇报
文章作者：Wangyan
原文链接：https://www.wangyan.life/archives/skills/genecircuit
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最后修改：2023 年 1 月 10 日